Smac模擬物LCL161抑制乳腺癌細胞體內外增殖及其機制的研究摘要
乳腺癌是一類具有較高異質性的腫瘤。在組織形態、免疫表型、臨床表現、疾病進展、治療反應和轉歸及預后等方面都存在著很大的差異,所以乳腺癌的治療是在規范化的基礎上更要求個體化。目前的治療方案的選擇,多建立在臨床分期和分子分型的基礎上,以手術為主的,化療、放療、內分泌和靶向等治療的合理、有效、序貫進行的綜合治療。但是,最終有相當部分患者因為復發和轉移而治療失敗,多數是因為對治療方法產生耐受而導致的。細胞凋亡過程的調控異常也是腫瘤細胞耐藥的原因之一,如何通過促進腫瘤細胞的凋亡抑制腫瘤的生長是目前抗腫瘤研究是一個熱點方向,本課題試圖根據腫瘤細胞凋亡失控的特性尋找新的靶點。在腫瘤的調控機制中,腫瘤凋亡抑制蛋白家族(IAPs)發揮著重要作用,第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激動劑(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac)通過降解IAPs而對腫瘤發揮抑制作用。LCL161,是一種Smac小分子模擬物,通過綁定并參與下調多種IAPs,并通過激活caspase誘導細胞凋亡。研究表明,LCL161對多發性骨髓瘤、肝細胞肝癌、白血病等腫瘤細胞株有明顯的抑制其增殖,促進細胞凋亡的作用,在聯合化療、放療或靶向治療中能發揮協同作用,可能提高治療效果;動物實驗研究表明,LCL161對部分實體瘤有一定的抑制作用;I期臨床實驗顯示,口服LCL161,人體耐受性良好,吸收佳,毒性作用低。已有的研究均表明,LCL161是極有潛力的抗腫瘤活性成分,然而,其抗腫瘤的確切作用機制、臨床療效等方面尚缺乏明確報道。同時在關于LCL161在乳腺癌方面的研究上鮮有報道,具有極大的研究空間和價值。目的:觀察LCL161對乳腺癌細胞株的增殖能力的影響,并探討其誘導乳腺癌細胞株凋亡的可能機制,通過動物體內實驗進一步證實其對乳腺癌的治療效果,為LCL161成為乳腺癌新藥的研究提供理論基礎。方法:1.觀察LCL161對乳腺癌細胞增殖能力的影響。1.1MTT法檢測不同濃度和作用時間條件下,LCL161對乳腺癌細胞增殖能力的影響。1.2集落形成實驗觀測不同濃度的LCL161對乳腺癌細胞集落克隆形成能力的影響。2.LCL161誘導乳腺癌細胞細胞凋亡的作用及機制。2.1 PI染色檢測不同濃度LCL161對乳腺癌細胞細胞凋亡率的變化。2.2 JC-1檢測不同藥物濃度下線粒體膜電位的變化。2.3免疫印跡法(western-blot)在蛋白水平上檢測細胞凋亡相關蛋白(Bax、Bak、Mcl-1)和凋亡抑制蛋白(cIAP1、cIAP2、XIAP)的蛋白表達情況。3.LCL161聯合z-VAD-fmk誘導乳腺癌細胞程序性壞死的作用和機制。3.1 MTT法檢測LCL161聯合z-VAD-fmk對乳腺癌細胞增殖能力的影響,觀察LCL161誘導的凋亡對Caspase的依賴性。3.2 MTT法檢測LCL161聯合Nec-1對乳腺癌細胞增殖能力的影響,觀察單藥LCL161是否誘發了程序性壞死。3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測LCL161和/或z-VAD-fmk和/或Nec-1干預乳腺癌細胞株后細胞凋亡比例的變化,推測LCL161聯合z-VAD-fmk是否能誘發兩種乳腺癌細胞程序性壞死的發生。3.4電子顯微鏡下觀察LCL161和/或z-VAD-fmk和/或Nec-1干預后乳腺癌細胞株細胞亞微結構的變化,從細胞形態學上觀察LCL161聯合z-VAD-fmk是否能使乳腺癌細胞株發生了程序性壞死。3.5小干擾RNA(siRNA)受體相互作用蛋白1(RIP1)后,MTT法比較RIP1干擾前后細胞存活率的變化,探討RIP1在LCL161聯合z-VAD-fmk誘導乳腺癌細胞株程序性壞死信號途徑中的作用。4.動物模型的建立和藥物對乳腺癌裸鼠模型的影響。4.1動物模型的建立和藥物實驗,觀察體內實驗中LCL161對乳腺癌移植瘤的抑制效果。4.2免疫組化檢測實驗組和對照組腫瘤細胞c IAP1的蛋白表達情況結果:1.MTT法和克隆實驗同時觀察到:以LCL161不同給藥濃度(1n M,10n M,100n M,1μM以及10μM)或不同作用時間點(24h、48h、72h)為變量,觀測兩種乳腺癌細胞株的細胞增殖生長情況。LCL161對MDA-MB-231和MCF-7兩種細胞株的增殖和集落形成能力都有一定的影響:在同樣的觀察點上,存在濃度的相關性,隨著給藥濃度的增加,抑制的效果越明顯。在同樣的濃度上,存在作用時間的相關性,隨著作用時間的增加,抑制的效果越明顯。2.PI染色:通過流式細胞儀的檢測,可以比較直觀而且量化凋亡細胞和正常細胞的比例。應用LCL161干預后,MDA-MB-231和MCF-7細胞株在0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM時,計算出凋亡的細胞的比例分別是2.9%、8.8%、15.1%、21.5%、56.7%和2.4%、5.4%、13.3%、20.0%。表明隨著藥物濃度的增加凋亡的細胞的比例是呈逐步上升的趨勢。3.檢測濃度分別為0μM、0.5μM、1μM、2μM的LCL161處理后乳腺癌細胞株的線粒體膜電位的變化情況。在兩種細胞株中,隨著LCL161的濃度的遞增,可以觀察到紅色熒光在逐漸減弱,而綠色熒光在逐漸增強,即JC-1單體在增多,多聚體的量逐步下降。推測出線粒體膜電位在逐步下降。4.應用western-blot法檢測,隨著LCL161的濃度逐漸增高,兩細胞均表現如下:Bax基因蛋白表達呈遞增趨勢,而Mcl-1、Bcl-2基因蛋白的表達呈遞減趨勢。應用western-blot法檢測細胞凋亡抑制蛋白cIAP1、cIAP2、XIAP的表達情況,從實驗的結果可以觀察出:1.隨著藥物作用時間的延長,cIAP1的蛋白的表達在兩個細胞株中都存在逐漸減少的趨勢。2.同樣的方法和時間點,但是觀察到cIAP2、XIAP的蛋白的表達變化不明顯。 5.MTT法檢測LCL161誘導的乳腺癌細胞凋亡對caspase的依賴性,觀察應用泛caspase抑制劑z-VAD-fmk阻斷由caspase介導的細胞凋亡以后,細胞的存活率變化。本階段實驗發現:單獨應用z-VAD-fmk后,MDA-MB-231細胞和MCF-7的存活率分別為90.9%和94.0%,而LCL161聯合z-VAD-fmk應用后出現細胞存活率(42.3%和69.3%)相對單用LCL161(70.0%和88.0%)明顯下降(p=0.002和p=0.006),因而推測z-VAD-fmk聯合LCL161后可能激活了其它類型的細胞死亡方式。6.MTT法觀測LCL161和Nec-1單藥和聯合處理MDA-MB-231和MCF-7兩種乳腺癌細胞株存活情況。聯合應用后應出現細胞存活率(81.3%和84.6%)與單用LCL161(78.5%和82.8%)無統計學差異(p=0.062和p=0.253),說明單藥應用Smac的模擬物LCL161不會誘導程序性壞死的發生。再一次證實LCL161聯合z-VAD-fmk可能激活了程序性壞死的啟動,從而誘發更劇烈的細胞死亡。7.Annexin V-FITC/PI雙染法觀測到:在針對MDA-MB-231細胞株7個實驗組(空白對照、LCL161、z-VAD-fmk、Nec-1、LCL161+Z、LCL161+N和LCL161+Z+N)中,藥物處理24小時后,觀測到早期細胞凋亡的比例分別是0.9%、16.8%、0.8%、0.6%、72.4%、6.1%和7.7%,中晚期細胞凋亡的比例分別是1.8%、15.5%、1.7%、1.2%、20.8%、6.3%和2.7%。在同樣處理的MCF-7的7個實驗組中,觀測到早期細胞凋亡的比例分別是0.0%、12.3%、11.0%、8.5%、34.1%、6.6%和5.8%,中晚期細胞凋亡的比例分別是0.0%、7.3%、6.5%、2.7%、59.6%、12.5%和3.1%。LCL161+Z相比較于單藥LCL161能顯著降低細胞的存活率,LCL161+Z+N相比較于LCL161+Z能提高乳腺癌細胞的存活率。說明LCL161+Z誘發了乳腺癌細胞的程序性壞死。8.在電鏡下觀察細胞中亞微結構的變化:在LCL161和LCL161+Nec-1組,細胞凋亡特征明顯,細胞膜完整、胞漿可見凋亡小體,染色質固縮;在LCL161聯和z-VAD-fmk組,凋亡和壞死特征共同存在,細胞膜結構幾乎消失,可見空泡、出芽,胞漿凋亡小體可見,核仁基本完整,說明存在了程序性壞死。 9.RIP1干擾實驗:單獨加z-VAD-fmk組細胞存活率97.0%和99.0%;單獨加LCL161組,細胞存活率下降,細胞存活率分別為80.0%和84.0%;聯合LCL161+z-VAD-fmk組細胞存活率(61.0%和59.0%)和聯合LCL161+z-VAD-fmk control siRNA組細胞存活率(53.0%和62.0%)相近,細胞存活率明顯下降;聯合LCL161+z-VAD-fmk RIP1 siRNA組,細胞存活率(77.0%和83.0%)上升。10.本實驗可以觀察到RIP1干擾后,LCL161聯合z-VAD-fmk應用后引起的細胞的存活率較非干擾組顯著升高(p=0.001和p=0.001)。11.在動物體內試驗觀測到LCL161對三陰乳腺癌瘤體的抑制效果(質量和體積)類似于阿霉素。12.免疫組化觀察到,應用LCL161的動物的瘤體中c IAP1的蛋白表達都出現不同程度的降低。結論:1.LCL161能顯著地抑制乳腺癌細胞的增殖并誘導其凋亡,其作用機制可能誘導IAP家族蛋白的降解有關。2.Caspase抑制劑可增強LCL161的抑制乳腺癌存活的作用,其產生療效的可能機制是激活細胞程序性壞死通路引起的。RIP1在程序性壞死過程中起到重要的作用。3.乳腺癌裸鼠模型研究證明,LCL161具有體內抗腫瘤的作用,LCL161作為乳腺癌的新的治療藥物具有一定的臨床研究前景。
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